Методика работы при использовании мембранных фильтров

1. Подготовка мембранных фильтров.

Мембранные фильтры  должны быть подготовлены к анализу в соответствии с указаниями изготовителя.

Воронку и столик фильтровального аппарата обтирают марлевым ( ватным ) тампоном, смоченным спиртом ректификоваггым, и фламбируют. После охлаждения на столик фильтровального аппарата кладут фламбированным пинцетом стерильный мембранный фильтр, прижимают его воронкой.

В воронку прибора для фильтрования наливают отмеренный объем воды, затем создают вакуум.
После окончания фильтрования и осушения фильтра отключают вакуум, воронку снимают, фильтр осторожно поднимают за край фламбированным  пинцетом и переносят его, не переворачивая, на питательную среду, разлитую в чашки Петри, избегая пузырьков воздуха между средой и фильтром. Поверхность фильтра с осевшими на ней бактериями должна быть обращена вверх.
Под каждым фильтром на дне чашки делают надпись с указанием объема профильтрованной воды, номера пробы и даты посева. На одну чашку можно поместить 3-4 фильтра с условием, чтобы фильтры не прикасались.
Проведение анализа.

Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 С в течении 24 часов, видимые с увеличением в 2 раза. При отсутствии роста учет проводят через 48 часов.

Из каждой пробы делают посев не менее двух объемов по 1 мл.
После тщательного перемешивания пробы воды вносят по 1 мл в стеклянные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают  8 -12 мл ( на чашку диаметром  90- 100 мм) расплавленного и остуженного до 45-49 С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара.

Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний.
Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц в 1 мл исследуемой пробы воды.
Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий методом мембранной фильтрации.

Общие колиформные бактерии- грамотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на дифференциальных средах, ферментирующие лактозу( глюкозу) до кислоты, альдегида и газа при температуре 37+/-1 С в течение 24-48 часов.
Термотолерантные колиформные бактерии входят в число общих колиформных бактерий, обладают всеми их признаками и, кроме того, способны ферметировать лактозу (глюкозу) до кислоты, альдегида  и газа при температуре 44+/-0,5 С в течении 24 часов.

Метод основан на фильтрации установленного объема воды через мембранные фильтры, выращивании посевов на дифференциальной питательной среде с лактозой и последующей индитификацией колоний по культуральным и биохимическим свойствам.

Порядок исследования.
При исследовании питьевой воды анализируют 3 объема по 100 мл.
При получении стабильных отрицательных результатов допускается фильтрация 300 мл воды через 1 фильтр.
Фильтры помещают на среду Эндо. Чашки  фильтрами ставят в термостат дном вверх и инкубируют посевы при температуре 37+/-1 С в течение 24+/-2 часов.
Если на фильтрах нет роста или выросли колонии пленчатые, губчатые, плесневые, прозрачные, расплывчатые, выдают отрицательный ответ: отсутствие ОКБ и ТКБ в 100 мл исследуемой воды. Анализ заканчивается через 24 часа.
Если на фильтрах обнаружен рост изолированных типичных лактозаположительных колоний: темно- красных, красных с металлическим блеском или без него или бругих подобного типа колоний с отпечатком на обратной стороне фильтра, подсчитывают число каждого типа отдельно и приступают к подтверждению их принадлежности к ОКБ и ТКБ.
Для подтверждения наличия ОКБ исследуют:
- все колонии, если на фильтрах выросло менее 5 колоний;
- не менее 3-4 колоний каждого типа;
Для подтверждения наличия ТКБ исследуют все типичные колонии, но не более 10.
Каждую выбранную изолированную колонию исследуют на:
- наличие оксидазной активности;
- принадлежность к Граму ( микроскопия окрашенного по Граму препарата или постановка теста Грегерсена);
-ферментацию лактозы ( глюкозы) до кислоты и газа.
4. Учет результата.
1. Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном  оксидазном тесте и ферметации лактозы при температуре 37 С с образованием кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при температуре 44 С с образованием кислоты и газа.
2. При отсутствии общих и термотолерантных  колиформных бактерий на всех фильтрах результат записывают « не обнаружено КОЕ ОКБ в 100 мл» и « не обнаружено КОЕ ТКБ в 100 мл».
3. В случае индентификации всех выросших подозрительных колоний число колониеобразующих единиц  ОКБ и ТКБ подсчитывают на всех фильтрах и выражают результат анализа КОЕ в 100 мл воды.
Вычисления проводят по формуле:
X=a*100/V,
Где:
X- число колоний в 100 мл;
V- объем воды, профильтрованный через фильтры, на которых велся учет;

Примеры:

2*100/300=0,7    КОЕ ОКБ (ТКБ) в 100 мл

(4+3)*100/(40+100)=5   КОЕ  в 100 мл.
Если при выборочной проверке колоний одного типа получены неодинаковые результаты, то вычисляют числа ОКБ или ТКБ  среди колоний этого типа по формуле:
X=(a+c)/b,
Где :
X – число подтверждающих бактерий одного типа;

• Общее число колоний этого типа;
• Число проверенных из них;
• Число колоний с положительным результатом.